Сочетание необратимого ковалентного связывания и динамического отслеживания множественных реакции формирования фрагментных ионов для детектирования и количественного анализа низко- и ультранизкокопийных белков

Копылов А.Т., Згода В.Г., Арчаков А.И.

(PDF: Постер )

 

 

Введение

В работе предложена стратегия сочетания необратимого ковалентного связывания на активированной BrCN-Sepharose 4B и динамического отслеживания множественных реакций формирования фрагментных ионов (МРМ) для детектирования и количественного анализа низко- и ультранизкокопийных белков. Обогащение белков в биологических пробах из объемов от 0,5 до 50 мл способно расширить границы линейной зависимости площади хроматографического пика от концентрации, достигая предела детектирования до 10-18 М.

 

Методы

С помощью квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра высокого разрешения (Q-TOF) были определены прекурсорные ионы протеотипических пептидов бычьего сывороточного альбумина (БСА) и цитохрома ВМ3 (CYP102) из Bacillus megatherium. Полученные данные по прекурсорным ионам, их фрагментам и временам удержания на колонке использовали для разработки МРМ метода на масс-спектрометре с тройным квадруполем (QqQ). Для определения предела детектирования в режиме динамического МРМ готовили серию разведений БСА и CYP102 от 10-9 до -10-16 М. Для достижения более высокой чувствительности использовали оптимизированный метод обогащения белков в пробе путем необратимого ковалентного связывания на BrCN-Sepharose 4B. Готовили серию разведений чистых препаратов БСА и CYP102 или в присутствии плазмы крови человека в концентрации 10-12 – 10-20 М в объемах от 0,5 до 50 мл с последующим добавлением активированной Sepharose 4B. Связанные белки ферментативно расщепляли трипсином и полученную смесь пептидов анализировали динамическим МРМ.

Результаты

Показано, что масс-спектрометрический сигнал прекурсорных пептидных ионов 617.653+ и 875.922+ цитохрома ВМ3 и 740.392+ и 784.362+ БСА достигает передела детекции до 10-16 М. При это наблюдается линейность зависимости площади хроматографического пика от концентрации на протяжении шести порядков до 10-14 М для ВМ3 и 10-15 М для БСА с отношением уровня сигнала к шуму более 7,0 как для чистых препаратов белков, так и в присутствии плазмы крови человека. После концентрирования пробы на BrCN-Sepharose 4B из объёмов 0,5 – 50 мл был достигнут предел детекции пептидных ионов БСА и ВМ3 в концентрации до 10-18 М.

Вывод

Показано, что сочетанием необратимого ковалентного связывания белков в биологической пробе на активированной BrCN-Sepharose 4B с динамическим МРМ был достигнут предел детектирования концентрации до 10-18 М.