Лаборатория системной биологии

Основной задачей хромосомоцентричного проекта протеом человека (C-HPP) является регистрация “missing proteins” (PE2-PE4). Ранее, на модельном объекте UPS2, который имитирует концентрационный диапазон белков в клетке мы показали, что использование 2D фракционирования позволяет зарегистрировать более 95% белков UPS в сложной биологической смеси. В данной работе мы использовали 2D фракционирование для глубокого анализа белков, кодируемых 18 хромосомой человека в клеточной линии HepG2. Нам удалось повысить чувствительность метода SRM SIS в 1,3 раза (68 белков идентифицировано при одномерном фракционировании, 88 белков идентифицировано при двумерном фракционировании), а метода панорамного сканирования в 2,5 раза (21 белок хромосомы 18 идентифицирован при одномерном фракционировании, 53 белка идентифицировано при двумерном фракционировании). По итогам всех экспериментов было идентифицировано 111 белков, кодируемых 18 хромосомой человека, что составляет 42% протеома и 75% зарегистрированного транскриптома 18 хромосомы человека.

Эффективность противоопухолевой терапии во многом зависит от молекулярных особенностей опухоли. Поскольку внеклеточные везикулы опухолевого происхождения, включая экзосомы, содержат белки, которые характерны для клеток-продуцентов и могут быть обнаружены в биологических жидкостях, они представляют большой интерес для скрининга прогностических биомаркеров.

В нашей лаборатории проводится масс-спектрометрическое профилирование внеклеточных везикул, выделенных из линий клеток рака толстой кишки человека Caco-2, HT-29 и HCT-116, и из клеточных линий аденокарциномы легких NCI-H23 и A549. Применяя методы таргетной масс-спектрометрии с использованием стандартов изотопно-меченных пептидов, мы оценили уровни обычных экзосомных маркеров CD9, CD82 и HASP8. Всего во всех экспериментальных образцах был идентифицирован 651 белок как минимум с двумя пептидами.

Специфичными для ткани легкого экзосомальными маркерами оказались белки вовлеченные в альтернативный сплайсинг и обмен нуклеотидов DHX15 и CNP, а также интегрин бета 1 (ITGB1) и ретинол-индуцибельный белок GPRC5A. Для экзосом ткани толстой кишки специфичными оказались белки теплового шока HSPD1 и HSPE1, а также цитокератин 18 Специфичными для отдельных клеточных линий экзосомальными маркерами, оказались белки теплового шока, интегрины, белки, участвующие в биогенезе экзосом, сплайсинге, метаболизме РНК, реорганизации цитоскелета и клеточной адгезии, в регуляции клеточного роста, дифференцировки и апоптоза. Белки экзосом, отличающие выбранные клеточные линии, могут послужить потенциальными предиктивными и прогностическими биомаркерами.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 19-75-00044, эксперименты выполнены на оборудовании ЦКП Протеом человека (ИБМХ)

Дифференцировка клеток – уникальный биологический процесс, который определяет развитие сложного многоклеточного организма из единственной клетки, участвует в процессах старения, развития патологических состояний. В основе дифференцировки лежит цепочка молекулярных событий, необходимых для приобретения клетками зрелого фенотипа и основанных на высококоординированной регуляции генной экспрессии

Транскрипция и деградация мРНК, с одной стороны, и трансляция и распад белков – с другой, составляют две пары фундаментальных клеточных процессов, которые определяют жизненный цикл клетки и ее дифференцировку, в том числе. Каждый из процессов контролируется ген-регулирующими механизмами. Однако, фундаментальный вопрос о том, как информация, заложенная в геноме, процессируясь на этапах транскрипции, трансляции и деградации биомолекул, реализуется в индивидуальный протеом остается невыясненной ни на качественном, ни, тем более, на количественном уровне. Большая часть современных исследований направлена на изучение конечного итога этой сложной регуляции, а именно на определение кратных изменений в содержании мРНК или белков в ходе дифференцировки по сравнению с недифференцированными клетками. В нашем проекте мы предлагаем провести двумерную омиксную регистрацию изменений транскриптома и протеома в динамике: с одной стороны, измеряя скорость изменения концентраций мРНК и белков, с другой стороны, измеряя скорость их катаболизма (время полураспада) в процессе дифференцировки.

Таким образом, основной фундаментальной целью проекта является выяснение роли взаимоотношений процессов транскрипции, трансляции и распада белков и соответствующей мРНК при индуцируемой дифференцировке. Клетки линий HL-60 и NB4 являются востребованными модельными объектами для исследования молекулярной природы гранулоцитарной дифференцировки. Обе клеточные линии под воздействием ретиноевой кислоты (ATRA) приобретают фенотип зрелых гранулоцитов (нейтрофилов), характеризующихся сегментоядерной морфологией и экспрессией поверхностных маркеров CD11b и CD38. Миелоидные клетки линий HL-60 и NB4 отличаются на молекулярно-генетическом уровне: линия клеток NB4 несет химерный ген PML-RARα, образующийся в результате транслокации t(15;17) между хромосомами 15 и 17; клетки линий HL-60 несут ген RARα дикого типа, но характеризуются наличием делеции гена p53 и многократной амплификаций гена c-MYC. Двумерное исследование динамики изменений транскриптома и протеома клеток линий HL-60 и NB4 под действием ATRA позволит определить специфические для различного генотипа молекулярные механизмы индуцированной гранулоцитарной дифференцировки, зависящие от скорости транскрипции, трансляции и распада мРНК и белков. Клетки хронического миелолейкоза линии K562, невосприимчивые к действию ATRA, будут использованы в качестве отрицательного контроля ATRA-индуцированной дифференцировки. Среди потенциальных регуляторных молекул клетки следует особо выделить транскрипционные факторы (ТФ), обладающие способностью связываться с промоторными областями ДНК и активировать или, наоборот, супрессировать транскрипцию целевых генов. Так как данные белки локализованы в ядрах клетки, будет проведен количественный омиксный анализ очищенной ядерной фракции клеток, полученных в определенные временные точки после индукции дифференцировки. Считается, что регуляторные белки характеризуются наибольшей скоростью синтеза/деградации. Исследование скорости синтеза (времени полураспада) транскрипционных факторов на уровне мРНК и белков в клетках NB4 и HL-60 после добавления ATRA поможет получить дополнительную информацию для расшифровки механизма индуцированной гранулоцитарной дифференцировки.

Применение биоинформатических инструментов – алгоритмов, таких как анализ регуляторных путей и баз данных транскрипционных факторов (например, как реализовано в платформе geneXplain) для поиска ключевых регуляторов ATRA-респонсивных мРНК и белков позволит консолидировать транскриптомные и протеомные данные, а также даст возможность предсказать регуляторные молекулярные сети, за счет которых изменяется скорость обмена транскриптов/белков, и благодаря которым клетки приобретают зрелый гранулоцитарный фенотип.

Определение молекул, регулирующих скорость обмена мРНК и белков, представляет большой интерес не только с позиции фундаментальной биологии, но и с точки зрения развития таргетной терапии в медицине. Верифицированные регуляторы скорости обмена транскриптов и белков могут представлять собой потенциальные молекулярные мишени, воздействие на которые может изменять ход ATRA-индуцированной гранулоцитарной дифференцировки, например, вызывать резистентность, или, наоборот, повышенную чувствительность к индуктору.